siRNA介導的基因沉默：機制、技術與應用進展

時間：2025-04-30 熱度：397

一、siRNA簡介

小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）是一類長度為21-23個堿基對的雙鏈RNA分子，是RNA干擾（RNA interference, RNAi）通路的核心效應因子。1998年，F(xiàn)ire和Mello在線蟲中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象，揭示了siRNA通過序列特異性調控基因表達的能力，并于2006年獲諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。siRNA的合成方式包括化學合成、體外轉錄或通過載體在細胞內表達，其高效性和特異性使其成為基因功能研究與疾病治療的熱點工具。

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圖1 RNA干擾機制

二、作用機制與分子基礎

siRNA介導的基因沉默依賴于細胞內RNA誘導沉默復合體（RISC）的組裝與激活。其核心步驟如下：

1、siRNA加載：雙鏈siRNA進入細胞后，被RISC識別并結合，其中一條鏈（引導鏈）被保留，另一鏈（過客鏈）被降解。

2、靶標識別：RISC-siRNA復合物通過堿基互補配對結合靶mRNA。

3、基因沉默：若匹配完全，RISC內的Argonaute蛋白（如AGO2）發(fā)揮內切酶活性，直接切割mRNA；若部分匹配，則通過抑制翻譯或招募其他調控因子（如去腺苷酸化酶）促進mRNA降解。

該過程不改變基因組序列，僅調控轉錄后水平的基因表達，具有高特異性和可逆性。

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圖2 siRNA形成RISC后發(fā)揮作用

三、實驗設計與技術方法

1、siRNA設計：

靶序列選擇：避開mRNA二級結構區(qū)域，優(yōu)先選擇AA（N19）TT或類似序列，確保GC含量在30%-60%之間。
脫靶效應控制：通過生物信息學工具（如BLAST）篩選非特異性結合位點，或采用化學修飾（如2'-O-甲基化）增強特異性。

2、遞送系統(tǒng)：

化學轉染：陽離子脂質體（如Lipofectamine）或聚合物（如PEI）包裹siRNA，適用于體外細胞實驗。
病毒載體：慢病毒或腺相關病毒（AAV）可實現(xiàn)siRNA的長期穩(wěn)定表達。
納米顆粒：基于脂質或聚合物的納米載體可提高體內遞送效率，降低免疫原性。

3、效果驗證：

mRNA水平：qRT-PCR檢測靶基因表達量下降；
蛋白水平：Western blot或免疫熒光分析蛋白表達抑制；
功能驗證：通過表型實驗（如細胞增殖、凋亡檢測）確認基因沉默的生物學效應。

四、應用領域與前沿進展

1、基礎研究：

基因功能篩選：高通量siRNA文庫用于全基因組功能缺失性研究，解析信號通路機制。
疾病模型構建：靶向致病基因的siRNA可模擬基因敲除表型，助力疾病機制解析。

2、臨床治療：

腫瘤治療：如靶向KRAS或BCL-2的siRNA抑制癌細胞生長（如MRX34臨床試驗）。
抗病毒應用：針對SARS-CoV-2的siRNA（如ALN-COV）可阻斷病毒復制關鍵蛋白。
遺傳?。篎DA批準的Patisiran（Onpattro）通過沉默TTR基因治療轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性。

3、農業(yè)與生物工程：

作物改良：siRNA介導的植物病毒抗性（如抗煙草花葉病毒品種）；
合成生物學：調控代謝通路關鍵酶表達，優(yōu)化產物合成效率。

五、挑戰(zhàn)與未來方向

盡管siRNA技術前景廣闊，其臨床轉化仍面臨遞送效率低、脫靶效應和體內穩(wěn)定性差等瓶頸。新型化學修飾（如GalNAc偶聯(lián)）和器官靶向遞送系統(tǒng)（如肝靶向脂質納米顆粒）正在突破這些限制。隨著CRISPR等技術的興起，siRNA與基因編輯工具的聯(lián)合應用或將為精準醫(yī)學開辟新維度。

END

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