為了確定神經(jīng)回路的輸入輸出組織，本研究自主開發(fā)了TRIO(示蹤輸入組織與輸出組織之間的關(guān)系)和cTRIO(特殊性細(xì)胞大熱TRIO)方法。

TRIO鑒別A區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞，A區(qū)的神經(jīng)元與B神經(jīng)元之間有一種突觸聯(lián)系，并向C區(qū)投射。A-B連接是狂犬病病毒（簡稱RVdG）通過反向跨突觸示蹤引起的，是狂犬病病毒（簡稱RVdG）感染引起的一種新的神經(jīng)退行性疾病。B區(qū)初始細(xì)胞可表達(dá)狂犬狂犬病毒糖蛋白（G）及TVA受體（TC），并于RVdG結(jié)合，使B區(qū)初始細(xì)胞與RVdG結(jié)合，使其能夠通過突觸傳遞至 A區(qū)前突觸神經(jīng)元。

TRIO中TC、G基因的表達(dá)依賴于Cre，而B去則由AAV介導(dǎo)。Cre是一種重要的神經(jīng)傳導(dǎo)蛋白，其功能主要是通過犬腺病毒2（簡稱CAV）介導(dǎo)。然而，TRIO無法分辨B區(qū)的各種細(xì)胞。

在cTRIO，將Cre酶的B區(qū)特異的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。在B區(qū)域，TC、G的表達(dá)依賴于CAV-FLEx-loxP-Flp重組酶的特異性C區(qū)域。因此，只有能夠?qū)re轉(zhuǎn)運(yùn)至C區(qū)的B細(xì)胞才能作為RVdG跨突觸示蹤的初始細(xì)胞。

本研究采用TRIO及cTRIO分別對大鼠運(yùn)動皮質(zhì)（MC）進(jìn)行干預(yù)。本項(xiàng)目擬通過體外培養(yǎng)和動物模型，將CAV-Cre注入MC，并用AAV-ELEx-loxP-TC/CG注入MC。結(jié)果顯示了MC第2/3層（L2/3）\L5（圖1F，左側(cè)；L6為初始細(xì)胞。）

cTRIO（cTRIO）將CAV-FLFxloxp-Flp注入Rbp4-Cre小鼠的cMC和延髓（Me），靶向定位于皮質(zhì)內(nèi)外的L5神經(jīng)元。同時(shí)向MC內(nèi)注入AAV-FLExFRT-T/G；這樣就會使初始細(xì)胞局限在MCL5（圖1F,中點(diǎn)和右邊)，正如Rbp4-Cre的表達(dá)模式所預(yù)測的那樣。

通過控制實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，在TRIO的CAV-Cre和cTRIO的CAV-FLFxloP-Flp、Rbp4-Cre中，狂犬病毒可以標(biāo)記大部分長程傳入神經(jīng)元。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，與TRIO想比，cTRIO能將初始細(xì)胞限定在更多的亞群，且在皮層下及胼胝體向L5神經(jīng)元同時(shí)接收來自丘腦或皮質(zhì)的信息。TRIO同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在大鼠的胼胝體和紋狀體中，有一種與肥大細(xì)胞相關(guān)的前突觸伴侶。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，CAV的擴(kuò)散具體位置多在200um內(nèi)，而且也有可能感染軸索通路。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，CAV-Cre在Ai4小鼠5個(gè)腦區(qū)分別注入CAV-Cre，發(fā)現(xiàn)在上述腦區(qū)投射的神經(jīng)細(xì)胞（部分離注射點(diǎn)>1 cm）都得到了有效的標(biāo)記。因而， CAV能夠遠(yuǎn)距離侵染多種神經(jīng)纖維的軸突及末梢。

目前已經(jīng)確定了5個(gè)腦區(qū)：嗅球、聽皮層、海馬、小腦以及延髓，它們都能接收到藍(lán)斑核-去甲腎上腺素的投射。將CAV-Cre注入Ai14小鼠后，發(fā)現(xiàn)藍(lán)斑核內(nèi) NE （NE）能神經(jīng)元。

相比后腦投射的LC-NE神經(jīng)元，前腦投射的LC-NE神經(jīng)元更偏向背側(cè)。

本研究為LC-NE神經(jīng)元的突觸輸入了第一次全腦定量分析。

這項(xiàng)研究提供的病毒基因工具，也可用于研究哺乳動物腦內(nèi)其它環(huán)路，如運(yùn)動皮質(zhì)。TRIO，尤其是 cTRIO，是對以往選擇性投射定位技術(shù)的拓展，使之可以應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜回路分析。在此基礎(chǔ)上，我們還將使用CAV-FLFxloxp-Flp等多種 Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，研究其交叉投射和細(xì)胞類型，從而實(shí)現(xiàn)對特定神經(jīng)元群的調(diào)控。